Western blot/CCK8/MTT/Transwell細胞遷移

背景：
蛋白質(zhì)印跡的發(fā)明者是斯坦福大學George Stark。Neal Burnette于1981年所著的AnalyticalBiochemistry中*被稱為Western Blot。開始做印跡的是一個叫Southern的科學家，但印跡的對象是DNA鏈，他把這種技術稱為Southern blot，后來出現(xiàn)了兩個過程相似，但是對象不同的印跡方法，一個針對RNA，一個對蛋白質(zhì)，人們分別把這兩種技術的稱為Northern和 Western，與這兩個技術的發(fā)明人沒有關系了。

一、蛋白質(zhì)的樣品制備：
由于這一步方法各異，具體步驟請參考試劑盒的說明書即可。蛋白質(zhì)的樣品制備是Western Blotting的*步，樣品制備是關鍵步驟，要求盡可能的獲得所有蛋白質(zhì)，應注意以下問題：
       > 在合適的鹽濃度下，應保持蛋白質(zhì)的大溶解性和可重復性。
       > 選擇合適的表面活性劑和還原劑，破壞所有非共價結合的蛋白質(zhì)復合物和共價鍵二硫鍵，使其形成一個各自多肽的溶液。盡量去除核酸，多糖，脂類等干擾分子。
       > 防止蛋白質(zhì)在樣品處理過程中的人為的修飾，制備過程應在低溫下進行，以避免細胞破碎釋放出的各種酶類的修飾（加入合適的蛋白酶抑制劑）。
       > 樣品建議分裝成合適的量（比如分裝出20ul檢測蛋白質(zhì)定量用），然后保存與-20°或-80℃中長期保存，但要注意不要反復凍融，因為會使蛋白的抗原特性發(fā)生改變。
       > 若蛋白提取過程存在問題或蛋白發(fā)生降解則很難進行好之后的實驗，也就很難做出好的結果了。除此之外 loading buffer的作用也不容忽視，切莫使用不新鮮的上樣緩沖液，同時在處理時也應注意將樣品與loading buffer混合均勻。
Western Blot
二、蛋白質(zhì)定量：
如果要定量的話，一般選擇BCA或者Bradford方法，BCA要求檢測波長為562nm，Bradford為595nm。具體方法見各試劑盒說明 書。為避免假陽性結果，建議先把lysis buffer加入BCA工作液或考馬G250混合看是否產(chǎn)生顏色。測完蛋白含量后，計算含50~100ug蛋白的溶液體積即為上樣量（一般8cm寬的迷你 膠每個泳道大能承載的蛋白質(zhì)量為150ug，所以如果從組織提取蛋白的話上樣量不宜過大）。網(wǎng)上有人喜歡等質(zhì)量上樣（即每個泳道的上樣體積不一但質(zhì)量一 定），也有使用等體積上樣（即先把各個樣品稀釋到某一固定濃度，然后等體積等質(zhì)量上樣，計算上樣體積時需包含loading buffer的體積）。按分子克隆的說法，還是使用等體積上樣比較好。上樣總體積一般不超過15ul，加樣孔的大限度可加20ul樣品。上樣前要將樣品 置于燒杯內(nèi)，將燒杯置于石棉網(wǎng)上用酒精燈加熱至沸騰，在沸水中煮3~5min使蛋白充分變性。也可以使用PCR儀95°加熱5min，效果佳，操作方便。 之后樣品可以在4℃冰箱短時間保存，也可在-20°冰箱保存數(shù)月，但是反復凍融會使蛋白質(zhì)的抗原特性改變。

三、SDS－PAGE電泳
       1、清洗玻璃板：
蘸點洗潔精輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖，再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。若不繼續(xù)使用，需用無水乙醇擦拭后晾干再妥善收起來，玻璃板之間墊玻璃紙隔開。梳子應用水洗干凈，臨用前用無水乙醇擦拭晾干。
       2、灌膠與上樣
① 玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準備灌膠（操作前先往玻璃板間灌水，檢查是否漏）。
② 按配膠試劑盒說明書選擇合適的分離膠濃度配置，后加入TEMED，之后搖勻即可灌膠。配制凝膠時要充分混勻，此外應保證試劑的新鮮，特別是過硫 酸銨。灌膠時掌握好速度，避免氣泡產(chǎn)生（注意濃度越小的膠含水越多，凝固后膠體積縮小越多）。然后膠上加一層水，液封后的膠凝的更快（灌膠時開始可快一 些，膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下，這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要很慢，否則膠會被沖變形）。未聚合的丙烯酰胺具有神 經(jīng)毒性，操作時應該戴手套防護。梳子插入濃縮膠時，應確保沒有氣泡。注意給積層膠留出足夠的空間（分子克隆推薦長度為插入的梳齒長再加1cm）。
③ 當水和膠之間有一條折射線時，說明膠已凝了。再等幾分鐘覺得差不多的時候就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。聚合時間由AP以及TEMED決 定，通常在30min左右，AP不新鮮會導致聚合變慢，氣溫較低時膠是會凝得慢一些，必要時可適當增加AP以及TEMED的量，但通常不會超過1h，若超 過1h甚至更長仍未聚合，應檢查配制的操作有無錯誤。由于TEMED催化APS釋放相關化學基團，再由APS釋放的基團催化Acr/Bis聚合，所以如果 APS不新鮮的話加再多的TEMED效果也不佳，這就是為什么推薦APS每周新鮮配置的原因。
④ 按說明書配積層膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡 產(chǎn)生。插梳子時要使梳子保持水平。由于膠凝固時體積會收縮減小，從而使加樣孔的上樣體積減小，所以在濃縮膠凝固前在兩邊補膠至剛剛冒頂。待到濃縮膠凝 固后，兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。
⑤ 趁積層膠聚合的這段時間，取適當體積樣本混合1X SDS loading buffer（事前分裝好，每次從冰箱里取一管即可），95~100°加熱5min，若有沉淀可用稍低溫度，比如45~55°加熱1h達到變性的目 的。我一般習慣分裝20ul到PCR管里，先和loading buffer混合好，臨用前用PCR儀加熱95°C 5min，效果不錯。
⑥ 膠做好后連同玻璃板一起安裝到電泳槽上，加入電泳緩沖液后開始準備上樣（我們使用的是大連競邁科技公司的MV-III型小型單垂直板電泳槽，電泳 液至少要漫過內(nèi)測的小玻璃板，電泳槽下面不用倒太多電泳液）。加樣前可用5ml注射器或加樣器先沖洗一下加樣孔。用微量加樣器貼壁吸取樣品，將樣品吸出不 要吸進氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品（加樣太快可使樣品沖出加樣孔，若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時，進樣器需在外槽電泳緩沖 液中洗滌3次，以免交叉污染。目前我們做的mini膠上有10個上樣孔，一般在*個孔加入marker（我用的是Fermentas預染 marker），其余9個孔加入樣品，也可在頭尾孔內(nèi)加入marker，中間8個孔加樣品。加樣前樣品應先離心，尤其是長時間放置的樣品。在未加樣的孔中 應加入等量的樣品緩沖液。上樣時，小心不要使樣品溢出而污染相臨加樣孔。也可使用10ul的槍頭就行，比用微量加樣器快很多，用槍頭時注意不要插得太深， 容易把玻璃板撐開，樣品就落到膠和玻璃板之間的空隙了。

Western Blot
       3、 電泳
       電泳槽內(nèi)加入電泳緩沖液沖洗清除黏附在凝膠底部的氣和未聚合的丙烯酰胺，網(wǎng)上有資料建議低電壓短時間的預電泳，清除凝膠內(nèi)的雜質(zhì)，疏通凝膠孔徑以保證電泳 過程中電泳的暢通，但是在《分子克隆》上卻反對這種做法，理由是會破壞緩沖系統(tǒng)pH的不連續(xù)性。請各位按照實際經(jīng)驗來做即可。電泳時間和電壓說法各異。按 照各實驗室的慣例或者電泳槽的使用說明來操作。電泳至溴酚蘭剛跑出即可終止電泳，進行轉(zhuǎn)膜。為減少蛋白質(zhì)條帶的擴散，上樣后應盡快進行電泳，電泳結束后也 應直接或者轉(zhuǎn)印。

四、轉(zhuǎn)膜
以下以使用半干轉(zhuǎn)膜為例。對于轉(zhuǎn)印90kd以下的蛋白，轉(zhuǎn)膜液都不用加SDS，如果是蛋白分子量大的話可以加入0.037%的SDS。
1、 在電泳結束前20min開始準備轉(zhuǎn)膜所需的東西。轉(zhuǎn)一張膜需準備6張的濾紙（長一般為8.1~8.3cm，寬度根據(jù)裁的膠大小實際測量，但膠一般會縮水， 所以裁8cm就行）和1張PVDF膜。切濾紙和膜時一定要戴干凈手套，因為手上的蛋白會污染膜。PVDF膜使用前用無水甲醇中浸泡1min~2min。目 的是為了活化PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質(zhì)結合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時多加甲醇也是這個目的。
2、將玻璃板撬開才可剝膠，撬的時候動作要輕，要在兩個邊上輕輕的反復撬。撬一會兒玻璃板便開始松動，直到撬去玻板（撬時一定要小心，玻板很脆弱，我 用的是冰箱里附帶的塑料除霜鏟，效果出奇的好）。除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去，要避免把分離膠刮破。也可取10ml注射器吸滿轉(zhuǎn)印緩沖液，往玻璃板 與凝膠之間注水，使液體的壓力將兩者自然分開。取出凝膠后應注意分清上下，可以在右上角裁一個小角。之后有兩種方法供選擇，一是按照marker指示，把 含有自己感興趣的蛋白的膠裁下來，二是把整張膠轉(zhuǎn)膜，前一種方法更加節(jié)約材料，但操作稍微麻煩了一點。在加有轉(zhuǎn)移液的培養(yǎng)皿里放入裁好的膠、浸過甲醇的 PVDF膜和濾紙，平衡10min左右，也是為了除去濾紙和轉(zhuǎn)移膜中的氣泡以及膠上多余的SDS。
  3、帶上手套，平放轉(zhuǎn)移槽的底座，依次在石墨電極上疊放3張浸泡過緩沖液的濾紙、PVDF膜（此時可在PVDF右上角減去一個角，以辨明轉(zhuǎn)膜后的蛋白面 與非蛋白面）、剛剛完成電泳的凝膠和另外3張浸泡過緩沖液的濾紙。用槍頭或移液管在疊層的濾紙上滾動，除去氣泡。注意每疊一層就要用玻璃棒或圓筒試管趕去 氣泡，因為一個氣泡的厚度對于蛋白來說都是十萬八千里的。用干凈紗布將疊層上面和周圍的多余緩沖液吸干（這一步很重要，寧可太干也不能太濕，太干容易燒 胡，太濕的話多余的緩沖液會導致電流短路，大大降低轉(zhuǎn)移效率，如果同時轉(zhuǎn)好幾條膠的時候更要小心，有一個膠短路就會影響整體的轉(zhuǎn)移效率）。后將轉(zhuǎn)移槽的 上蓋扣上，接通電源開始轉(zhuǎn)膜。由于設備昂貴，*次操作應向熟手請教，否則短路可能燒壞設備！轉(zhuǎn)完后立即清洗設備，特別是金屬上蓋，轉(zhuǎn)膜液特別容易在金屬 上蓋上形成結痂，影響設備的正常使用，我們實驗室今年做western的同志因為忽略這一點，轉(zhuǎn)膜儀燒壞了好幾次。
4、依據(jù)分子量大小電泳15~60min。如果初次轉(zhuǎn)膜，可以根據(jù)一般經(jīng)驗，即多少kD的蛋白就轉(zhuǎn)多少分鐘，再根據(jù)結果調(diào)整時間。之后斷開電源，取出轉(zhuǎn)移膜進行后繼實驗。
5、為了便于觀察電泳效果和轉(zhuǎn)膜效果，以及判斷蛋白分子量大小，使用預染。傳統(tǒng)方法是將膜用1×麗春紅染液染5min（于脫色搖床上搖）。然后用 水沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。實際上更常用且簡便的方法是先將膜晾干，然后浸入20%的甲醇，待*浸濕后取出透光觀察即可看到蛋白條帶（此 方法僅僅適合PVDF膜）。將膜晾干備用。使用預染marker話可以看見marker的顏色轉(zhuǎn)印到了膜上，但是憑借這個顏色來判斷是否轉(zhuǎn)印*或轉(zhuǎn)印過 頭是不可靠的。
Western blot/CCK8/MTT/Transwell細胞遷移
五、免疫雜交反應
1、將膜移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1h即可。如果是自己配置的封閉液，過濾一下以消除固體雜質(zhì)。實際經(jīng)驗表明與其封閉過夜，不如一抗孵育過夜。
2、將一抗用封閉液稀釋（一般用封閉液稀釋即可，如果背景不高用TBST稀釋也可以，當然熟練后還可以自由發(fā)揮，配制一些自己的復方稀釋液）至適當濃 度（可以在1.5mlEP管中配置工作液，常用稀釋倍數(shù)為1:200，1:500，1:1000，具體需要預實驗進行摸索，用后可回收重復用2~3次，但 回收重復利用的效果如何就要看抗體的質(zhì)量，分裝的抗體不推薦回收。稀釋后應在2－3天內(nèi)使用，4度保存，避免反復凍融。）；撕下適當大小的一塊兒保鮮膜鋪 于實驗臺面上，四角用水浸濕以使保鮮膜保持平整；將抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，掀動膜 四角以趕出殘留氣泡（也可使用手術室的病理袋，質(zhì)量不錯，減去下面的折疊部分，用封口器（40~80元一個）封上，不漏液即可）。37°孵育1h之后轉(zhuǎn)移 到室溫下再孵育1h（或者4°孵育過夜），用TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min；再用TBS洗一次，10min。也可以多洗幾次，比如4 次，每次5min。
3、在培養(yǎng)皿內(nèi)加入二抗稀釋液（10ml足夠了，一般1:1000甚至1:10000用TBST稀釋），放在搖床上，室溫下孵育1～2h后，用 TBST在室溫下脫色搖床上洗兩次，每次10min；再用TBS洗一次，10min，進行化學發(fā)光反應。選擇好一個合適的條件不要輕易改變，另外相比一 抗，二抗作用的時間應嚴格控制，實踐證明一抗時間長點可能沒什么關系，而二抗時間若過長過短都將會直接影響結果。二抗孵育之后還要注意好好洗滌，否則顯影 是背景可能臟。

六、化學發(fā)光（ECL）
現(xiàn)在工作臺上鋪一張保鮮膜，將PVDF膜放在保鮮膜上。將ECL的A和B兩種試劑在EP管內(nèi)等體積混合（注意吸完A試劑后吸B試劑前要患槍頭），然后 均勻滴在PVDF膜的蛋白面，反應1~2min后，將PVDF膜上多余的ECL工作液吸干，之后轉(zhuǎn)移到在X片夾中預先鋪好的保鮮膜上一側，把另一側翻過來 蓋在其上。用透明膠把保鮮膜固定在片夾上。

七、凝膠圖象分析
        將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目標帶的分子量和凈光密度值，比如bio-rad的Quantity One。

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